表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

人白介素—12（P40）亚基在巴斯德毕赤酵母中的表达

运用PCR技术特异性地扩增了IL－12p40亚基cDNA的编码区序列,得到940bp的扩增片段,将其克隆于毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαC的ClαⅠ,XbaⅠ位点,构建成重组表达质粒pPICZαC-p40。经LiCI2转化,Zeocin抗性筛选,得到含多拷贝p40基因的酵母工程菌Pichia pastoris X-33/p40,在φ=0.5%甲醇诱导下,p40基因得到了分泌型表达,培养上清的SDS－PAGE及Westem-blot均显示表达产物相对分子质量约44000,与预计大小相符,薄层凝胶扫描结果表明,分泌型表达占培养上清总蛋白量质量的47％。     

重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定

按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZa中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.     

人Cu,Zn-SOD在酵母系统中的表达

甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ基因克隆到酵母整合型质粒载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ，经转化ｈｉｓ４缺陷型酵母ＧＳ１１５，用ＭＤ培养基及ＰＣＲ方法筛选阳性转化子，并用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基筛选多拷贝转化子，经甲醇诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ，经计算机扫描分析，表达量占酵母可溶性     

枯草芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,以pHBM003为模板,扩增得到寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因,克隆至毕氏酵母（Pichia pastoris）表达载体pHBM905上,获得重组毕氏酵母表达载体pHBM9053．将此质粒分别转化毕氏酵母GS115、KM71和SMD1168菌株,筛选获得重组毕赤酵母GS115（pHBM9053）、KM71（pHBM9053）和SMD1168（pHBM9053）;然后进行摇瓶诱导培养,这3株毕氏酵母分别在诱导培养60h、48h和24h后,酶活力达到最高,对应为2．233u／mL、0．34u／mL和1．235u／mL;GS115（pHBM9053）所产寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为6,在30～75℃、pH8～9范围内较稳定．     

花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达

 采用聚合酶链反应从花鳗鲡垂体cDNA中分别扩增出GTHα、LHβ基因,再利用搭桥技术,中间以linker将两个基因连接成单个基因LHβα。然后利用双酶切、连接,将LHβα基因连接到载体pPICZαA中,构建出促黄体生成素的酵母共表达载体pPICZαA-LHβα。再利用电转化法将其转入到酵母野生型菌株X-33中,在含不同浓度的zeocinYPDS平板上筛选高拷贝转化子,阳性克隆经φ=0.7%甲醇诱导表达,表达产物采用SDS-PAGE和western blot进行分析,得到所表达的产物相对分子质量约为45 000。     

黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达

通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)对黑曲霉的来源外切葡聚糖酶基因(cbh1)的氨基酸序列进行分析,发现其16个活性部位中有6个位点附近的氨基酸为毕赤酵母(Pichia pasto-ris)表达的稀有密码子。利用反向长距离PCR技术将这些活性位点附近的稀有密码子定点突变为毕赤酵母表达偏爱密码子。将优化后的表达载体pPICZαA-cbh1m转入毕赤酵母KM71H菌株中进行诱导表达。经密码子优化后的cbh1m基因较未优化前cbh1基因的表达量提高了17%。     

菊黄东方鲀卵黄蛋白原肽段vWD的真核重组表达及功能研究

河鲀的卵黄蛋白原可能参与河豚毒素（TTX）的体内转运过程。为了探讨该机理,建立了毕赤酵母真核表达系统,成功地表达了菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）卵黄蛋白原的vWD结构域肽段（rTF_vWD）,并采用Biacore-表面等离子体共振（SPR）系统检测了rTF_vWD与TTX的亲和力,以及腹腔注射小鼠验证rTF_vWD对TTX毒力的中和作用。结果表明:rTF_vWD与TTX的平衡解离常数（KD）为3.1 mmol/L;将TTX与rTF_vWD共孵后肌肉注射小鼠,2 h内小鼠的死亡率显著下降,表明TTX与rTF_vWD结合后,TTX的毒性降低了。     

甘蔗糖蜜总糖中提高蔗糖纯度的菌株分离鉴定及生物纯化性能

从甘蔗糖厂周边环境采集污泥、土壤及污水样品,通过甘蔗糖蜜纯化发酵试验筛选提高甘蔗糖蜜总糖中蔗糖纯度的菌株,并对菌株进行形态观察、生理生化特征比较和26SrDNA基因序列同源性分析鉴定。结果筛选获得1株提高甘蔗糖蜜总糖中蔗糖纯度的菌株m-6。菌株m-6纯化发酵10h,甘蔗糖蜜中葡萄糖、果糖的去除比例分别为96.5%、100%,蔗糖在糖蜜总糖中的纯度由初始的55.6%提高至85.7%,菌株m-6对甘蔗糖蜜有良好生物纯化作用。菌株m-6属于库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.